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1. 流動(dòng)相的pH：在IPC中pH不僅影響分析物的離子化程度，也影響加入的IPRs的離子化進(jìn)而影響與分析物的離子對(duì)作用，因此pH的改變對(duì)分析物保留的影響更加復(fù)雜。

2. IPRs的類型和濃度：大多數(shù)情況下，固定相中IPRs的濃度會(huì)影響溶質(zhì)的IPC保留行為，而IPRs的類型和濃度會(huì)直接影響其在固定相中的濃度。前面在介紹傳統(tǒng)的IPRs時(shí)提到烷基鏈長(zhǎng)度和濃度對(duì)分析物的保留有著非常相似的影響，也就是當(dāng)想要獲得一定的保留時(shí)，可以使用更低濃度的疏水性更強(qiáng)的IPRs或者更高濃度的疏水性更弱的IPRs。當(dāng)固定相中的IPRs達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)增加IPRs的濃度反而會(huì)降低分析物的保留，因?yàn)镮PRs的反離子濃度增加，加大與分析物的離子交換競(jìng)爭(zhēng)。

流動(dòng)相的pH和IPRs的濃度的同時(shí)改變，則可以在很大程度上控制離子樣品的保留范圍和相對(duì)保留值。

3. 溶劑強(qiáng)度（%B）：我們知道在RP-HPLC中，%B的改變會(huì)使離子樣品的**保留值和相對(duì)保留值都發(fā)生改變。對(duì)于IPC，%B的增加同時(shí)還會(huì)減少I(mǎi)PRs在色譜柱上的吸附，進(jìn)一步減少與之配對(duì)的分析物的保留。

4. 溶劑類型：由于B溶劑會(huì)對(duì)IPRs在色譜柱上的吸附造成額外的影響，因此相對(duì)于常規(guī)RP-HPLC而言，IPC中改變?nèi)軇╊愋蜁?huì)引起選擇性更大的改變。

對(duì)于難以分離的離子樣品，綜合改變流動(dòng)相的pH、IPRs的濃度和溶劑類型是非常有效的。

5. 溫度：IPC中溫度的改變會(huì)引起相對(duì)保留值發(fā)生顯著性的變化。溫度會(huì)改變色譜柱上吸附的IPC試劑的量，因此控制溫度對(duì)分離特別重要。

6. 色譜柱類型和緩沖液：和常規(guī)的RP-HPLC不同的是，由于色譜柱固定相表面被IPRs部分覆蓋，因此色譜柱的類型對(duì)IPC的分離影響相對(duì)沒(méi)這么大，因此通過(guò)改變色譜柱的類型和達(dá)到控制IPC的選擇性并不是**的辦法，也不會(huì)特別有效。而緩沖液的類型和濃度對(duì)于IPC分離非常重要，但是更可預(yù)見(jiàn)的選擇性變化則可通過(guò)改變上述的其他因素來(lái)實(shí)現(xiàn)。

可能出現(xiàn)的問(wèn)題和解決方法

1. 人工峰（artifactual peaks）：在IPC中，當(dāng)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)（即注入樣品溶劑）時(shí)，正峰和負(fù)峰有時(shí)候都可以觀察到，這些異常的峰也被稱為人工峰（artifactual peaks）。這些人工峰會(huì)干擾HPLC方法的建立或日常應(yīng)用，因此在IPC方法建立之前和得到有希望的分離之后都應(yīng)該進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

人工峰問(wèn)題通常是由流動(dòng)相和樣品溶劑之間的差異造成的，使用的緩沖劑純度不夠、離子對(duì)試劑或者其他流動(dòng)相添加劑都會(huì)放大這種影響。

解決方法：

a. 讓樣品溶劑盡量接近流動(dòng)相的組成，比如直接用方法的初始流動(dòng)相溶解樣品；

b. 增加進(jìn)樣濃度、減少進(jìn)樣體積（如<50 μl）;

c. 使用不同批次和廠家的離子對(duì)試劑來(lái)對(duì)比。

2. 緩慢的色譜柱平衡：相對(duì)于不添加離子對(duì)試劑的RPC，IPC由于涉及到多種復(fù)雜的平衡過(guò)程，因此一般來(lái)說(shuō)RPC的色譜柱平衡時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。因此，當(dāng)一種或者兩種流動(dòng)相中都含有離子對(duì)試劑時(shí)，改變流動(dòng)相后必須證實(shí)樣品保留值能夠重現(xiàn)，才可開(kāi)始使用。當(dāng)使用的離子對(duì)試劑疏水性較強(qiáng)（例如庚烷磺酸鹽與己烷磺酸鹽）或季銨鹽試劑（如四丁基銨）時(shí)，柱平衡通常較慢。

由于平衡較慢，當(dāng)使用IPC時(shí)選擇梯度洗脫方法可能會(huì)導(dǎo)致一系列的問(wèn)題，比如保留值重現(xiàn)性較差、基線不穩(wěn)及其它一些分離問(wèn)題，因此通常不推薦IPC中使用梯度方法。但對(duì)于使用小分子離子對(duì)試劑如三氟乙酸（TFA）和三乙胺（TEA）時(shí)，其柱平衡較快，使用梯度洗脫一般也沒(méi)問(wèn)題。

當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)目前選擇的離子對(duì)試劑不合適而想換一種離子對(duì)試劑時(shí)，如果不更換色譜柱，*好先充分清洗原來(lái)色譜柱中的離子對(duì)試劑，再用新流動(dòng)相平衡色譜柱。不同的離子對(duì)試劑有不同的清洗方法：

對(duì)于陰離子試劑（如磺酸鹽）：用50-80%的甲醇-水清洗；

對(duì)于季銨鹽類試劑：用50%甲醇-緩沖劑（100-200 mM）(如pH 4-5，100 mM磷酸鉀)清洗，其中加入磷酸鉀的目的是降低試劑銨基與硅羥基發(fā)生作用。

在用新流動(dòng)相檢查保留值重現(xiàn)性之前，至少應(yīng)使用20倍柱體積的清洗溶劑進(jìn)行清洗。

3. 峰形問(wèn)題：一般來(lái)說(shuō)，加入離子對(duì)試劑會(huì)改善由于硅膠基質(zhì)色譜柱上殘留硅醇基團(tuán)帶來(lái)的峰形問(wèn)題。如果在IPC中出現(xiàn)峰形問(wèn)題，如峰前延等，改變溫度可能是有效的解決方式。因此當(dāng)遇到峰形不好和/或塔板數(shù)降低時(shí)，*好研究一下溫度變化對(duì)峰形的影響。